导读

免疫黑木耳含有多种营养成分

黑木耳作为一种珍贵的黑木传统食用真菌，不仅能为人体提供氨基酸、耳胞蛋白质、外多微生膳食纤维等营养物质，糖对态及还具有抗氧化、小鼠响抗肿瘤、肠道降血糖和预防心血管疾病等多种活性功能。免疫黑木耳含有多种营养成分，调节的影其中所含多糖成分的黑木作用研究较为广泛，尤其是耳胞在食品和保健品开发方面具有应用价值，如黑木耳饮料、外多微生黑木耳口服液等。糖对态及研究发现，小鼠响黑木耳多糖能够显著提高机体免疫力，肠道抑制小鼠脾淋巴细胞转化增殖能力，免疫增强其巨噬细胞吞噬能力和自然杀伤细胞活性。肠道微生物是人体的重要代谢“器官”，在消化吸收、新陈代谢和免疫反应等生命活动中发挥关键性作用。随着对肠道微生物与机体健康研究的深入，发现正常生理条件下人体肠道菌群处于动态平衡状态，当内环境变化或受到外界刺激时，会导致肠道内菌群紊乱，对机体健康产生影响。例如，抗生素滥用会破坏肠道微生物种群平衡，增加炎症性疾病风险。益生菌通过分泌一系列抗菌物质（有机酸、过氧化氢和细菌素等）降低肠内pH，增加短链脂肪酸（Shortchainfattyacid，SCFA）含量来减少病原体活菌数。研究发现，多糖可以促进肠道优势菌增殖和调节肠道内分泌物，从而促进肠道内环境稳态和机体健康。

尽管黑木耳具有较高的营养价值和广阔的应用前景，但是其多糖成分对肠道微生物的调控作用与机制仍不清楚。为了明晰黑木耳多糖对肠道菌群变化的调控效应及其生物功能，本研究利用小鼠模型，分析黑木耳胞外多糖对小鼠肠道菌群多样性、SCFA含量变化及血清细胞因子的影响，为黑木耳多糖益生菌微生态制剂和新型健康食品的开发提供理论基础。

1材料与方法

1.1原料与试剂

黑木耳菌株（GenBank：KF297975.1，天津科技大学生物医药与分子生物学实验室保存）。无水乙醇（分析级）、葡萄糖（分析级）、浓硫酸（分析级）、二甲苯（分析级），天津北方天医化学试剂厂；三氯甲烷（分析级）、异戊醇（分析级）、二氯甲烷（色谱级），上海生工生物工程有限公司；乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸、戊酸、异戊酸，上海源叶生物科技有限公司；柠檬酸钠抗原修复液，上海碧云天生物技术有限公司；牛血清白蛋白，北京索莱宝科技有限公司；GPR43抗体，圣克鲁斯生物技术（上海）有限公司；FIＴC标记的荧光二抗，赛默飞世尔科技（中国）有限公司；酶联免疫吸附（ELISA）试剂盒，上海茁彩生物科技有限公司。

1.2实验动物

SPF级近交系CD-1雌鼠18只，体重（20±3）g，实验动物许可证号：SCXK（京）2016-0006，购于北京维通利华实验动物技术有限公司。

1.3仪器设备

AB204-S型分析天平，梅特勒-托利多仪器上海公司；GH-6000型电热恒温培养箱，天津市泰斯特仪器有限公司；ALPHA2-4/LD型冷冻干燥机，德国CHRIS公司；722型紫外分光光度计，上海精科仪器公司；7890A气相色谱仪，美国安捷伦科技有限公司；BX53正置荧光显微镜，日本Olympus公司。

1.4黑木耳胞外多糖提取

黑木耳发酵培养参照肖彩霞的方法。发酵液经3000r/min离心20min弃沉淀，上清液直接进行真空蒸发，浓缩至原体积的1/4，加入无水乙醇（体积分数30%），4℃过夜。3000r/min离心20min后，向上清溶液加入去蛋白试剂（三氯甲烷异戊醇=1∶4）并磁力搅拌10min，3500r/min离心15min弃沉淀，上清液加入无水乙醇（体积分数75%）4℃过夜。4000r/min离心15min取得沉淀物即为粗多糖，将多糖沉淀用水复溶后透析12h，每2h换1次水，随后冷冻干燥，得到黑木耳胞外多糖。

1.5多糖的鉴定及单糖组成分析

1.5.1多糖的红外光谱解析

称取黑木耳胞外多糖1mg，加入适量溴化钾（KBr）粉末于研钵中，充分研磨后压成透明薄片，随后用NicoletIS10FＴIR光谱仪（ＴhermoScientific，美国）在400～4000cm-1波数范围内扫描，记录IR光谱。

1.5.2多糖的单糖组成分析

本试验利用高效液相色谱仪，结合PMP（1-苯基-3-甲基-5吡唑啉酮）柱前衍生化法对黑木耳胞外多糖样品进行了单糖组成分析。多糖的水解和衍生化方法参照王媛媛等研究。高效液相检测条件如下：C18色谱柱；流动相为0.1mol/LpH6.5磷酸缓冲盐∶乙腈（V/V）=85∶15；流速1mL/min；柱温40℃；检测波长250nm；进样量20μL。

1.6动物试验

1.6.1实验动物分组及处理

将购买的18只健康CD-1雌性小鼠饲养在20～22℃、45%～55%RH的无菌洁净环境中，让其自由进食（市售普通饲料），适应性喂养7d。将其随机分为2组（每组9只）即试验对照组（Control），黑木耳胞外多糖组（Fermentation-exopolysaccharide，F-P）。将黑木耳胞外多糖用生理盐水配置，然后按照1.5g·kg^-1BW^-1进行灌胃处理（每只小鼠每次给药体积为0.2mL），连续灌胃21d；对照组给予等体积的生理盐水处理。

1.6.2小鼠体重及脏器系数

试验期间每7d记录1次小鼠体重，将两组体重平均值做趋势分析。第21天，脱臼法处死小鼠后，快速分离肝、脾、心、肺、肾等脏器，脏器用吸水纸吸干后，进行称量和数据采集，最后对脏器系数及安全性进行评估。

脏器系数=（脏器质量/体重）×100%。

1.6.3小鼠肠道菌群分析鉴定

灌胃试验结束后（第21天），无菌采集新鲜粪便0.1g，放入灭菌管，将待测样品交派森诺生物科技有限公司进行菌群鉴定分析。流程如下：首先提取样品细菌总DNA，然后以微生物核糖体RNA目标序列为靶点，设计16SrRNAＶ3-Ｖ4区的特异性引物，等温扩增构建文库。构建好的文库经梯度稀释，利用IlluminaMiSeq测序平台高通量测序。测序结果通过生物信息学方法进行亚基因组分析和肠道微生物区系分析。

1.6.4小鼠粪便中SCFAs含量分析

冷冻干燥粪便样品，准确称取50mg样品，加入1.2mL磷酸盐缓冲液（pH7.3）混匀，4℃14000r/min离心20min，吸取上清液至5mL离心管中。每200μL上清加入0.1mL的稀释后硫酸（体积分数50%），充分混匀3min，用2mL二氯甲烷（色谱级）进行萃取，4℃静置2h，然后用0.22μm有机滤膜过滤。采用气相色谱（GC）检测样品中短链脂肪酸的含量，样品提取方法参照Zhao等并做部分修改。GC分析采用常规HP-FFAP（25m×0.32mm，0.5μm）配置柱，程序设定参照贾益群等在生物样品脂肪酸提取与分析的研究结果，并调整其分流比为20∶1。SCFA标准品溶液的配置以及标准曲线绘制参照孟拓等对气相色谱-质谱联用法分析肠道炎小鼠短链脂肪酸代谢研究结果。

1.6.5小鼠结肠GPR43检测

小鼠灌胃21d后，脱臼法处死小鼠快速分离肠道交武汉谷歌生物科技有限公司制作石蜡切片。取结肠石蜡切片用二甲苯脱蜡处理，经不同浓度梯度乙醇进行水化处理后用柠檬酸钠抗原修复液95℃温育15min进行抗原修复，并将其冷却到室温，经3%BSA室温封闭处理30min后用GPR43抗体4℃孵育12h，之后用FIＴC标记的荧光二抗室温避光孵育1.5h，再用DAPI室温避光孵育30min，实施封片并过夜风干，于暗室条件下进行荧光显微镜观察。

1.6.6小鼠血清细胞因子测定

小鼠灌胃21d后，通过摘眼球取血，并将血液保存在含有乙二胺四乙酸络合剂（EDＴA）的收集管中，4℃存放3h。待自然沉降后，用无菌枪头吸取血清，利用酶联免疫法（ELISA）测定小鼠血清中IL-6、IL-10和ＴNF-α的含量。试验步骤参照上海茁彩生物科技有限公司ELISA试剂盒操作说明书。

1.7统计学分析

试验结果采用Graphpad5.0分析软件统计分析，t检验分析各组间显著性差异，数据以x-±s表示，当P＜0.05时，认为具有显著性差异。

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