结晶紫,超高以N,效液相色析N-二甲基苯胺为原料,谱串谱法品中经过加工得到成品,联质留干是检测结晶一种三苯基甲烷染料。结晶紫用途广泛,水产素分多用于消毒、紫残杀菌、扰因生物染色剂、超高兽药、效液相色析饲料等。谱串谱法品中结晶紫以其杀菌效果好,联质留干保鲜效果佳的检测结晶特点,多年来广泛用于水产养殖业和水产品长途运输。水产素分然而,紫残研究发现结晶紫易被生物组织吸收,在生物体内代谢后生成具有致癌、致畸、高毒、高残留特性的隐性结晶紫。目前很多国家地区都将结晶紫列为水产养殖的禁用药物,我国目前也将结晶紫列为可食用动物禁用兽药。
近年来,可食用动物中违规使用结晶紫等药品的情况备受关注。欧盟要求水产品中结晶紫不得检出。2005年,我国发布实施的GB/T19857-2005《水产品中孔雀石绿和结晶紫残留量的测定》规定结晶紫的检测限为2.0μg/kg。
然而,检测过程中时常遇到试剂空白检出结晶紫,以及分析结果稳定性差的现象。国内有学者对结晶紫检测做了相关研究。吴淑秀等应用高效液相色谱串联质谱法测定了实验室检测过程中常用的笔、纸、标签、样品袋等用品中结晶紫的含量。结果表明,大部分供试物品均含有一定量的结晶紫,其中A4打印纸、标签纸和圆珠笔中含量很高。高华鹏等采用超高效液相串联质谱法测定了结晶紫和隐性结晶紫的含量,结果显示出实验室用品均能检出结晶紫。许荣富等用反相柱成功地分离出了结晶紫、甲基紫、碱性品蓝、碱性艳蓝B、铜酞菁和罗丹明B等几种有色染料成分,检测出圆珠笔的结晶紫含量。
本文针对水产品检测过程中结晶紫检测干扰因素进行分析,在不同的时间条件下,对试验可能接触的办公用品如纸、笔、标签纸,以及包装材料如留样用塑料袋中的结晶紫含量进行检测,从而得出随时间变化的干扰因素对检测结果的影响。
1材料与方法
1.1试剂与仪器
A4打印纸、送样样品标签纸、激光打印标签纸、黑色签字笔、黑色马克笔、蓝色圆珠笔:得力集团有限公司;实验室滤纸:塘玻(天津)实验仪器销售有限公司;留样用塑料袋:河源市华丰塑胶有限公司。乙腈(色谱纯):德国默克公司;乙酸铵(优级纯):天津科密欧化学试剂公司;结晶紫、隐性结晶紫:德国Dr.Ehrensorfer公司。1290/6460超高效液质联用仪、EclipsePlus色谱柱C18(5μm×100mm×2.1mm):德国Agilent公司;AL204-IC电子天平:上海梅特勒-托利多仪器;WAT200609固相萃取装置:沃特世Waters公司;HS501振荡器:IKA公司;1mL/cc一次性使用无菌注射器:浙江华福医用器材有限公司;尼龙膜过滤器(0.22μm,13mm):博纳艾杰尔科技有限公司;1mL进样瓶:浙江爱吉仁科技有限公司;2mL塑料滴管:上海晶安生物信息有限公司。
1.2试验方法
1.2.1标准溶液的配制
0.1μg/mL的结晶紫工作液的配制:精确移取0.01mL0.1mg/mL的结晶紫中间液,置于10mL容量瓶中,用乙腈定容至刻度线于4℃以下避光储存摇匀备用。
1.2.2样品前处理
将待测的A4纸、实验室滤纸、送样样品标签纸、激光打印标签纸和留样用塑料袋分别裁剪成2cm×2cm同样大小的纸片,如图1所示。把待测所用黑色签字笔、黑色马克笔、蓝色圆珠笔分别在2cm×2cm的空白实验室滤纸上用力均匀地分别书写一条、两条、四条长度为两厘米的印记并晾干,如图2所示。加入2mL乙腈浸提5min,涡旋振荡5min。浸提液经0.22μm滤膜过滤。
1.2.3不同提取时间对污染物含量影响
将裁剪好的相同滤纸中画相同两条黑色签字笔印记的纸、画有相同黑色马克笔印记的滤纸、画有相同蓝色圆珠笔印记的滤纸、相同送样样品标签纸、相同激光打印标签纸、相同留样用塑料袋分别放入50mL离心管中,加入2mL乙腈分别浸提5、10、30、60、120、240、360min和720min,浸提液经0.22μm滤膜过滤后用高效液相色谱-质谱联用仪检测污染物(显性结晶紫和隐性结晶紫)含量。重复5次作为平行试验,从而减小误差。
1.2.4仪器条件
1.2.4.1液相色谱条件
色谱柱:EclipsePlusC18,1.8μm×100mm×2.1mm(内径);流动相:A为500mL乙腈+500μL甲酸+0.385g乙酸铵,B为乙腈;流速:300μL/min;柱温:30℃;进样量:10μL。流动相梯度洗脱条件见表1。
1.2.4.2质谱条件
离子源:电喷雾离子源;扫描方式:正离子扫描;检测方式:多反应监测(multiplereactionmonitoring,MRM);电喷雾电压:4000V;壳气温度:350℃;离子源温度:300℃。
显性结晶紫和隐性结晶紫检测的质谱条件见表2。
1.2.5标准曲线的绘制
准确分别吸取结晶紫的标准工作液0、1、5、10、20、50、100μL至进样瓶内,依次分别加入乙腈1000、999、995、990、980、950、900μL至每个进样瓶内,配制成浓度为0、0.1、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0μg/L的结晶紫标准液。将不同浓度的标准液置于超高效液相色谱串联质谱仪,在最佳色谱条件下进行色谱分析,以保留时间定性,测定峰面积定量。以结晶紫及其代谢物浓度为横坐标,以结晶紫及其代谢物的液相峰面积为纵坐标绘制标准曲线,计算回归方程及其相关系数。
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