采用BrownleeCPPC18柱(2.1mm×50mm，分散1.7μm)进行分离，固相高效该色谱柱对极性和非极性化合物均有较好的结合保留，由于C18柱可能对含有长链烷基的液相季铵盐保留作用较强，洗脱所需时问较长，色谱容易引起色涪峰形拖尾。分散为了改善色谱峰形，固相高效实验时在流动相中加入了乙酸铵，结合为了验证这一猜想，液相本实验同时考察了日标分析物在甲醇-水、色谱甲醇-5mmol/L乙酸铵水溶液、分散5mm01/L乙酸铵甲醇溶液-5mm01/L乙酸铵水溶液等i种流动相体系下的固相高效色谱分离效果，结果发现未加入乙酸铵时，结合含有长链的液相季铵盐均有不同程度的拖尾，仅在水相中加入乙酸铵时也存在轻微的色谱拖尾现象，同时在水相和甲醇相中加入乙酸铵时月标物的峰形对称。实验继续考察了加入乙酸铵量分别为2.5、5、7.5、10mm01/L时色谱分离的效果，结果表明当乙酸铵在浓度为5和7.5mmol/L时，各季铵盐均能得到良好分离，且色谱峰尖锐，响应最为灵敏，最终选择了5mmol/L乙酸铵甲醇溶液和5mmol/L乙酸铵水溶液作为流动相。
适当的梯度淋洗程序能够使目标物在最短的时问内得到更好的分离，优化后的梯度程序BrownleeSPPC18柱(2.1mm×50mm，1.7μm)。梯度淋洗：A-5mmol/L乙酸铵水溶液，B-5mmol/L乙酸铵甲醇溶液；0.00～0.50min，30％A；0.50～3.00min，30％～10％A；2.00～4.00min，10％～2％A；4.00～6.50min，2％～0A；6.50～6.60min，0～30％A；6.60～7.00min，30％A；柱温箱温度：40℃色谱条件。实验同时考察了柱温箱温度为20、30、40、50℃时的情况，未能使实验结果出现明显变化，考虑到实验需要保持各项参数的稳定，故选择接近室温的20℃作为柱温箱温度。
季铵盐易失去卤素离子得到正离子，故选择EST+模式进行扫描。将配制好的各季铵盐抑菌剂标准溶液通过针泵引入的方式注入离子源进行离子化，先用Ql全扫捕确定标准品中目标物的[M-X]+的母离子峰，调整流速、入口电压(entrancev01tage，EV)、电离电压等参数使母离子峰达到最大值，再用子离子扫描模式，改变碰撞电压(c011isionv01tage，CE)值，选择两对信号最强、最稳定的子离子作为定性定量离子，优化其碰撞能量，使离子对的信号强度达到最大值，确定好以上参数后，采用多反应峪测模式(multiplereactionmonitoring，MRM)进行检测，各子离子的驻留时问为100ms。最终在优化的色谱、质谱条件下，得到如图1所示的各标准物质浓度为10μg/L时的多反应监测色谱图。TAC出峰快，保留时间0.74min，BDAB保留时间2.71min，DTAC保留时间2.42min，TDBAC保留时间3.19min，BDHAC保留时问3.74min，DDAC保留时问3.30min，六种季铵盐类抑菌剂在优化的条件下分离效果好，峰形对称。
通过对6种季铵盐类抑菌剂的极性考察，试验了水、乙腈、甲醇和乙醇4种极性溶剂对目标物的提取效果。结果如图2所示，其中水和乙醇的提取效果相对不佳，乙腈的提取能力优于水和乙醇，甲醇对6种季铵盐抑菌剂的提取效果最佳，可能是甲醇自身良好的渗透性和合适的极性使得其对目标物提取能力较强。
本研究同时考察了提取剂体积对目标物提取效果的影响，选取了5、7.5、10、12.5、15mL不同体积的甲醇作为实验条件。实验结果如图3所示，甲醇的提取能力随着体积的增加而增强，于10mL处趋于饱和，随着体积的继续增加，部分目标物如BDAB、DDAC的相对丰度反而下降，可能是过量甲醇提取引起的基质效应导致。综上所述，本研究最终选取10mL甲醇作为本方法的最终优化条件。
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