以多巴(L-DOPA)为底物,柚皮测定酪氨酸酶的苷氢活性。先将待测样品用无水乙醇溶解,抗氧配制成质量浓度为1Mg/ML的化活贮备液,再依次稀释成不同浓度的性研样品溶液。按表2所示,柚皮依次准确吸取不同浓度的苷氢样品溶液,pH6.8的抗氧0.5MoL/L磷酸盐缓冲溶液,0.5MMoL/LL-DOPA溶液和0.15Mg/ML酪氨酸酶溶液,化活充分混匀,性研在37℃水浴锅中孵育反应30MiN,柚皮然后立即测定各试管中反应溶液在475NM处的苷氢吸光值。上述试验均重复3次。抗氧根据酶反应活性的化活定义,在一定的性研抑制剂浓度下,酶反应活性表示为ACTi,在没有抑制剂时酶反应活性表示为ACT0,则受试样品对酶的相对抑制率(I)可以定义为:
式中,ACTi—有抑制剂时的酶反应活性;ACT0—没有抑制剂时的酶反应活性;A1,A2,A3,A4—1,2,3,4号反应液的吸光值。
称取50g重铬酸钾固体,以100ML蒸馏水100℃溶解(电炉加热),快速加入900ML浓H2sO4,混匀,冷却即可使用。MTT用PBs配制成质量浓度5Mg/ML,过0.22μM水相滤膜后存于10ML无菌离心管中,于-20℃冷冻保存。具体步骤:
20Mg,加入DMsO溶解配成500MMoL/L的母液,过0.22μM有机滤膜后以每管20μL分装于无菌的200μL离心管中,于-20℃冷冻保藏。
分别取柚皮苷、NariNgiNDC和熊果苷3种物质500MMoL/L的母液各4μL,加入4ML1640基础培养基中,配成500μMoL/L的溶液,然后分别稀释到250,125,62.5μMoL/L3个浓度。
在超净工作台中移取5ML75T细胞培养瓶终止消化后的细胞与培养液的混合液于离心管中,800r/MiN离心4MiN,弃上清液,移取3ML完全培养基于离心管并混匀细胞液,取上述1ML细胞液,加1ML完全培养基,取80μL于平板计数器计数,用完全培养基稀释调整细胞浓度为8000个细胞/100μL,用12通道移液枪将细胞液混匀,加入96孔细胞培养板,每孔加入100μL,做好标记后将细胞培养板放入CO2恒温培养箱培养24h。
将上述96孔细胞培养板放入CO2恒温培养箱培养24h,用废液真空泵吸弃细胞培养液,每孔加入不同浓度的样品150μL,并且每块96孔板都要留1到2列只加基础培养基做空白对照,做好标记后将细胞培养板放入CO2恒温培养箱培养24h。
在超净工作台中,取PBs配成质量浓度5Mg/ML的MTT溶液,与基础培养基以体积比1∶9的比例配成MTT细胞培养液。将步骤4)中加样品培养24h后的细胞培养液用废液真空泵吸弃,每孔加入150μLMTT细胞培养液,做好标记后将细胞培养板放入CO2恒温培养箱培养4h,吸弃MTT细胞培养液,每孔加入150μLDMsO,于酶标仪中振动10MiN后测定波长490NM处的吸光度值。
细胞存活率=(A0-Ax)/A0×100%
式中,A0—不加样品的空白吸光度值;Ax—加不同浓度样品作用后的吸光度值。
1)于超净工作台上,打开六孔板,置灭菌盖玻片。将细胞悬液滴加至盖玻片上,置CO2体积分数为5%的培养箱中,37℃培养至细胞固着(约2h),加入2ML细胞培养液继续培养约6h。弃培养基,用PBs洗3次,每次5MiN。
2)用4%多聚甲醛固定30MiN,PBs洗3次,每次5MiN。
3)切片稍甩干后在圈内滴加适量HoeChsT染液到爬片上,室温避光孵育15MiN。
4)PBs漂洗爬片3次,每次5MiN,从六孔板内取出爬片,将有细胞的一面封到滴加有抗荧光淬灭封片剂的载玻片上,荧光显微镜下观察并拍照。
采用CheMBioDrawULTra14.0画出化合物熊果苷和NariNgiNDC的结构,然后用CheMBio3DULTra14.0转化为三维结构,用MMFF94力场进行优化。双孢蘑菇酪氨酸酶的三维结构(PDBiD:2Y9X)从RCsB蛋白数据库下载。酪氨酸酶和化合物均使用AuTodoCkTooLs1.5.6转化为PDBQT格式。采用AuTodoCkviNa1.1.2进行分子对接。酪氨酸酶活性位点的坐标设置为:CeNTer_x=-10.044,CeNTer_y=-28.706,CeNTer_z=-43.443;size_x=15,size_y=15,size_z=15。为了增加计算的准确度,将参数exhausTiveNess设置为20。其它参数均用默认值。最后,选取打分值最高的构象用PyMoL1.7.6进行结果分析。
以TroLox作为对照,以其浓度-吸光值绘制标准曲线y=0.3627x+0.0661(R2=0.9943),研究柚皮苷、NariNgiNDC、NHDC及槲皮素4种样品对ABTs自由基清除效果,结果见图3。4种样品对ABTs自由基清除效果以TroLox的抗氧化物质的量表示,结果见表3。
由表3可知,4种样品对ABTs自由基均有清除作用。以TroLox作为对照,4种样品的总抗氧化能力结果中,柚皮苷的TroLox抗氧化物质的量为0.1748MMoL/g,NHDC为2.9109MMoL/g,NariNgiNDC为0.6986MMoL/g,槲皮素为39.6103MMoL/g。4种样品对ABTs自由基清除能力依次为槲皮素>NHDC>NariNgiNDC>柚皮苷。
以TroLox为对照,以其浓度-吸光值绘制标准曲线y=4.0588x+0.079(R2=0.9998),研究柚皮苷、NariNgiNDC、NHDC及槲皮素4种样品对羟自由基清除效果,结果见图4。4种样品对羟自由基清除效果以TroLox的抗氧化物质的量表示,结果见表4。
由表4可看出,4种样品对羟自由基均有清除作用,试验中以TroLox作为对照,得到柚皮苷清除能力的TroLox物质的量为19.8μMoL/g,NariNgiNDC为31.9μMoL/g,NHDC为44.4μMoL/g,槲皮素为365.5μMoL/g。4种样品清除羟自由基能力依次为槲皮素>NHDC>NariNgiNDC>柚皮苷。
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